免疫组织化学技术适用于冷冻切片和石蜡切片，部分抗体只能用于冷冻切片，大部分抗体可用于石蜡切片，适用于石蜡切片也适用于冷冻切片。冷冻切片能很好地保存组织抗原，抗原丢失少，但形态结构差，定位不很清晰；石蜡切片组织形态结构好，定位清晰，但在组织的固定脱水包埋过程中容易破坏组织抗原，使抗原的免疫活性有所降低。
（二） 组织的固定
组织经过固定可保存组织原有的形态结构，防止组织抗原弥散，常用的固定液为10%甲醛液，最好选用10%中性甲醛液，国定时间为4~6小时。固定时间不足，组织结构不佳，组织抗原弥散；固定时间过长，可封闭或破坏组织抗原。
（三） 载玻片的处理
组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色，由于染色工程操作步骤及冲洗次数较多，容易出现脱片现象，因此将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用较好的是采用硅化玻片。硅化玻片的制备：
1．载玻片经酸洗冲洗干净后烤干；
2．2%APES水溶液浸1~2min；
3．蒸馏水浸洗1~2min；
4 烤干备用。
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(四)组织切片前处理
经甲醛液固定，石蜡包埋的组织在固定过程中，组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联，使得组织中抗原的决定簇被封闭，抗体难以和抗原充分结合。因此要进行组织切片前处理，目的是打开组织抗原蛋白与甲醛的交联，暴露组织抗原，以提高组织抗原的检出率。组织切片前处理(也称抗原修复)常用的主要有以下方法:
本文来自实验室前沿
1．胰蛋白酶消化
将切片置入胰蛋白酶消化液 (0.2%胰蛋白酶 0.1%氯化钙水溶液 PH7.8 ) 消化30分钟，37℃。
2．微波加热
将切片置入0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液内，用微波炉最大功率加热10分钟，自然冷却。
3．高压锅加热法
用高压锅加热0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液至沸腾，放入切片，盖紧高压锅盖，继续加热至减压阀喷气，计时90秒钟至2分钟，自然冷却。
是否进行切片前处理要按第一抗原说明书的要求，切片前处理通常可以提高免疫组化染色的阳性率，但并非所有的抗体染色均需要前处理。
(五)内源性过氧化物酶的消除
组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶消除，方法是用3%过氧化氢作用15分钟。
(六)酶标抗体系统中的酶与显色剂
在LSAB等常用免疫组化方法中，与抗体连接的酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶(AP 或AKP), 显色剂有DAB、AEC、固红和固蓝等。在HRP系统用DAB和AEC等作显色剂，DAB显色阳性物呈棕色，AEC呈红色；AP系统用固红和固蓝作显色剂，固红显色阳性物呈红色，而固蓝呈蓝色。DAB显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色，较为常用，用其是致癌物，故要避免接触皮肤和污染环境。
(七)实验对照
为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
1．阳性对照:选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。初学者应设阳性对照。
2．阴性对照:选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性，一般来说，阴性对照和阳性对照同时进行，或其中有阳性染色结果时才有意义。
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(八)抗体的保存和稀释
抗体应于低温保存，第一抗体可分成少包装于-20度保存，使用时存放在4度，不宜反复存放于4度和-20度之间。检测试剂盒一般存放于4度，不宜于-20度保存，如长时间不用可存放于-20度，解冻使用后则不能再存放于0度以下，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。
浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。日常工作量不多时，可将抗体稀释至1:5~20，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。抗体稀释液可用0.01mol/L PBS Ph7. 4，在PBS中加入1%BSA和1%正常稀释后的稀释抗体，对减轻非特异性背景染色有所帮助。
（九）染色结果的观察
1．阳性结果应定位在细胞中相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：（1）细胞膜，如LCA和UCHL1等；（2）细胞质，如Keratin 和Lysozyme等；（3）细胞核，如PCNA和ER等。
2．组织的周边、刀痕、皱折等部位往往呈阳性表达，但绝大多数都是非特异性染色。
3．染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
4．组织切片背景深与下列因素有关：
（1）第一抗体浓度太高或孵育时间过长，温度过高。
（2）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多。
（3）正常血清封闭之后、滴加第一抗体之前用了PBS洗。
（4）抗体纯度不高、
（5）抗体孵育切片后洗不干净。 sysqy.com
（十）免疫组织化学染色后的复染背景
免疫组织化学染色后需要复染细胞核，以将组织细胞结构显示出来，使免疫组织化学染色结果定位清晰。免疫组织化学染色结果根据显色剂的不同而不同，有棕色、蓝色和红色，复染细胞核的颜色也因染液不同而不同，一般有劳色（苏木素）、绿色（甲基绿）和红色（核固红）三种。应根据颜色对比清晰的原则进行搭配，常用的是DAB显色呈棕色—Mayer`s苏木素复染细胞核呈蓝色。
（十一）染色操作注意事项
1．第一抗体分为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠和抗兔抗体，不能连接错，否则一抗、二抗连接不上而导致假阴性的染色结果。最好比选用即是抗鼠又是抗兔的抗体。
2．抗体孵育时间随孵育温度升高而减少，但一般不超过37度、如果不是由于诊断急于发报告，一般一抗置于4度孵育过夜较佳。
3．用于一种染色方法，因检测试剂盒的不同其敏感性不同，第一抗体的稀释度也不同。
