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噬菌体结合性检测样本的制备方法

时间:2011-09-01 23:33|来源:实验室前沿| 分享|点击:


 通常在一个用单价噬菌体展示实现了结合性富集的完整过程后,将会从剩下的克隆中分离出单链噬菌粒DNA并进行测序。虽然后面几轮的筛选可能产生相同序列,但由于其他的选择压力,相应的多肽却可能并不对应于具有最高亲和性的变异体。为了确保鉴定出最佳的序列,应该对较早和较晚的几轮筛选中得到的大量变异体的亲和力都进行测定。为了用噬菌体结合性检测来分析结合亲和性,我们从制备每个噬菌体的储备液开始。 sysqy.com

 
    常常可以用羧苄青霉素(carbenicillin)抗性来获得滴度为每毫升3×1014~5×1014个噬菌体的储备液。诸如氯霉素(chloramphenic01)的其他抗生素标记会降低噬菌体的活性,但是这个缺点完全可以通过降低抗生素浓度而使其降到最低。例如,我们的经验显示如g/ml的氯霉素足以维持氯霉素抗性的噬菌粒,但得到的滴度却完全可以高于从氯霉素浓度更高的培养基中所能得到的滴度。
 
    我们发现:通过在268nm处测定噬菌体的吸光度,并假设消光系数为0.2L/(nmol·cm),可以方便地评测它们的滴度。噬菌体储存的理想条件因被展示多肽的不同而有所变化,并且必须为每一个噬菌体—蛋白的融合物进行测定。我们通常把制备的噬菌粒放置在4℃的冰箱中并在2天内进行结合性检测。超过了这个时间,结合能力就会逐渐丧失,检测可靠性也会降低。一般来说,可以把分装后的噬菌体(每次使用一个分装)保存在-80℃中进行更长时间的保存。另外,还可以通过把噬菌体储藏在50%的甘油溶液中于-20℃保存来延长保存时间。
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责任编辑:何辉

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